實(shí)驗(yàn)技巧 | 血管生成實(shí)驗(yàn)—腫瘤項(xiàng)目必做實(shí)驗(yàn)之一

血管生長是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵步驟。無論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一旦生長直徑超過1~2mm，都會(huì)有血管生成，這是由于腫瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長因子，誘導(dǎo)血管生成。 

由于腫瘤組織這種新生血管結(jié)構(gòu)及功能異常，且血管基質(zhì)不完善，這種 微血管容易發(fā)生滲漏，因此腫瘤細(xì)胞不需經(jīng)過復(fù)雜的侵襲過程而直接穿透到血管內(nèi)進(jìn)入血流并在遠(yuǎn)隔部位形成轉(zhuǎn)移。越來越多的研究表明，良性腫瘤血管生成稀少，血管生長緩慢；而大多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長迅速，因此，血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，抑制這一過程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。

血管生成實(shí)驗(yàn)的技術(shù)原理主要是應(yīng)用Matrigel模擬機(jī)體環(huán)境，上面接種腫瘤細(xì)胞，觀察血管生成情況。

體外的血管生成實(shí)驗(yàn)?zāi)芎芎玫哪M腫瘤的血管發(fā)生過程，并且適合研究藥物對這一過程的影響實(shí)驗(yàn)。我們以HUVEC細(xì)胞為例，介紹這一實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)過程。

1、主要步驟

Step1：細(xì)胞培養(yǎng)

Step2：細(xì)胞轉(zhuǎn)染或藥物處理

Step3：鋪Matrigel膠

Step4：接種細(xì)胞

Step5：觀察血管生成情況

實(shí)驗(yàn)過程中需要注意：

1、實(shí)驗(yàn)前一天需要將Matrigel置于冰盒，放入冰箱中，同時(shí)需要準(zhǔn)備一些預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel膠；

2、將Matrigel膠加到血管生成載玻片時(shí)注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠；

3、需要按照細(xì)胞的生長速度定時(shí)采集圖像，并且對其成管長度、覆蓋面積、成環(huán)數(shù)和結(jié)點(diǎn)進(jìn)行測量和記錄，并且對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；

4、分上下孔的ibidi血管生成載玻片能去除凹液面，使成像效果更好。

（Matrigel鋪在下孔，細(xì)胞鋪在Matrigel上，上孔充滿培養(yǎng)基）

2、數(shù)據(jù)分析

（在特定的時(shí)間點(diǎn)采集圖片，并且進(jìn)行圖像分析（Wimasis全自動(dòng)分析）測量小管長度，成環(huán)數(shù)，細(xì)胞覆蓋面積和結(jié)點(diǎn)。之后在對測量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果。） 

三、實(shí)驗(yàn)具體步驟

1、準(zhǔn)備基質(zhì)膠 

1）實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4度冰箱，使膠能過夜緩慢融化。（注意：同樣要準(zhǔn)備一些4攝氏度預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）。

2）開始實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。

3）打開滅菌包裝，取出ibidi血管生成載玻片。 

4）每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。  由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng)，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確，有可能打入10μl的膠，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣，必然會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。

如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：

我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示，垂直透過每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說明膠沒加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。 

2、凝膠 

1）蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。

2）準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。 

3）將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。

4）將整個(gè)培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié)。 

5）等待同時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。  

3. 鋪細(xì)胞 

加入細(xì)胞的量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以在正式實(shí)驗(yàn)開始之前，要對不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。獲得最佳比例的細(xì)胞密度。我們今天的實(shí)驗(yàn)使用HUVEC細(xì)胞，每孔種10000個(gè)細(xì)胞即可。 

1） 準(zhǔn)備密度為2×105的細(xì)胞懸液，充分混勻。  

2）將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。 

3）每孔加入50μl的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠?？梢允褂门艠尅?nbsp;

4）同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒有，加入無細(xì)胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。 

5）蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細(xì)胞都會(huì)沉下去落在Matrigel的表面。  

4、采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果 

可以按照細(xì)胞的生長速度定時(shí)采集圖像，并且對其成管長度，覆蓋面積，成環(huán)數(shù)，結(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測量和記錄，并且對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。  

5、免疫熒光染色