EU新生RNA檢測(cè)試劑
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
細(xì)胞內(nèi)新生RNA的變化是評(píng)價(jià)細(xì)胞活性的重要指標(biāo)。EU (5-Ethynyl-Uridine) 是一種尿嘧啶核苷類似物, 能夠在細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄時(shí)期代替尿嘧啶(U) 摻入新合成的RNA分子中, 然后通過基于EU 與熒光染料的特異性共軛反應(yīng),把熒光集團(tuán)標(biāo)記到新合成的含有EU 的RNA分子中,這樣就可以進(jìn)行較快的的熒光檢測(cè)RNA的轉(zhuǎn)錄活性。本試劑盒將直接測(cè)定細(xì)胞內(nèi)新生RNA的變化。
傳統(tǒng)的檢測(cè)新生RNA的方法為以放射性同位素標(biāo)記RNA等方法然后進(jìn)行Southern blot進(jìn)行檢測(cè)。但是這種方法需要放射性同位素標(biāo)記及后續(xù)的復(fù)雜操作步驟。利用EU標(biāo)記新生RNA的檢測(cè)方法不需要?jiǎng)×业腞NA變性,只需溫和的細(xì)胞固定化和透化處理,能夠較好地保護(hù)細(xì)胞形態(tài)、RNA整體結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)抗原識(shí)別位點(diǎn),操作步驟更加便捷、靈敏和準(zhǔn)確,能在細(xì)胞水**映新生RNA轉(zhuǎn)錄活性的狀況。該試劑只需要簡(jiǎn)單的操作步驟,適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡以及高內(nèi)涵篩選儀進(jìn)行新生RNA的轉(zhuǎn)錄活性。
試劑組分
產(chǎn)品編號(hào) |
試劑 |
濃度 |
試劑量 |
C01901 |
EU 溶液 |
1000× |
40 μl |
細(xì)胞固定液 |
1× |
15 ml |
|
反應(yīng)緩沖液 |
10× |
1 ml |
|
催化劑溶液 |
25× |
400 μl |
|
TAMRA紅色熒光溶液 |
400× |
25 μl |
|
緩沖添加劑 |
粉末 |
200 mg |
|
Hoechst 33342 |
1000× |
20 μl |
運(yùn)輸及保存方式
藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃避光長期保存,避免反復(fù)凍融。如短時(shí)間內(nèi)需多次重復(fù)使用,請(qǐng)于4℃避光保存,有效期半年。
使用前須知
該試劑是采用成像檢測(cè)方法對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡等儀器。非貼壁細(xì)胞可在孵育EU后進(jìn)行細(xì)胞涂片處理,固定后再采用貼壁細(xì)胞的染色流程進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、蓋玻片
2、1×PBS(pH7.2-7.6)(用DEPC水配置)
3、含0.5% Triton X-100的PBS(用DEPC水配置)
4、甘氨酸溶液(2mg/ml) (用DEPC水配置)
5、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
實(shí)驗(yàn)參考
|
96孔板 |
48孔板 |
24孔板 |
12孔板 |
6孔板 |
EU培養(yǎng)基 |
100 μl |
200 μl |
300 μl |
500 μl |
1 ml |
染色反應(yīng)液 |
100 μl |
200 μl |
300 μl |
500 μl |
1 ml |
實(shí)驗(yàn)步驟(以96孔板,HK2貼壁細(xì)胞為例)
細(xì)胞培養(yǎng)
取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,以每孔4×103~1×105細(xì)胞接種于96孔板中,培養(yǎng)至正常狀態(tài)。
EU標(biāo)記
1、將細(xì)胞完全培養(yǎng)基中按照500:1的比例加入EU溶液,制成2×EU標(biāo)記培養(yǎng)基;
2、提前將2×EU標(biāo)記培養(yǎng)基預(yù)熱,然后等體積加入到細(xì)胞原有培養(yǎng)基中,獲得1×EU溶液,其中EU的終濃度為500 μM;
注:1)我們不建議替換全部培養(yǎng)基,因?yàn)檫@樣可能會(huì)影響細(xì)胞增殖的速度;
2)配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配,用量以沒過細(xì)胞為宜;
3、每孔加入300 μl含EU培養(yǎng)基孵育細(xì)胞2小時(shí),棄培養(yǎng)基;
注:1)培養(yǎng)時(shí)間取決于細(xì)胞的增殖速度和生長狀態(tài);
2)孵育時(shí)間至少2小時(shí),可延長至24小時(shí)后再檢測(cè)也可以。
4、以1×PBS清洗細(xì)胞兩次,每次5分鐘,以除去未摻入RNA的EU殘留。
注:貼壁不牢的細(xì)胞可降低清洗強(qiáng)度。
細(xì)胞的固定和通透
1、每孔加入150 μl 細(xì)胞固定液,室溫培養(yǎng)30分鐘,棄固定液;
注:1) 該試劑盒配備了細(xì)胞固定液,也可以使用含4%多聚甲醛的PBS來進(jìn)行細(xì)胞固定;
2) 如果使用其他的細(xì)胞固定劑建議用DEPC水來配置,避免RNA酶降解細(xì)胞內(nèi)的RNA。
2、每孔加入150 μl 2mg/ml 甘氨酸,搖床孵育5分鐘;
3、棄甘氨酸溶液,每孔加入300 μl PBS洗液,室溫清洗5分鐘;
4、每孔加入300 μl 0.5% Triton X-100細(xì)胞通透液,室溫通透10分鐘,棄細(xì)胞通透溶液;
5、每孔加入300 μl PBS洗液,室溫清洗5分鐘;
EU染色
1、通過用10:1去離子水稀釋10×反應(yīng)緩沖液進(jìn)行配制1×EU 反應(yīng)緩沖液;
2、按照溶解200 mg緩沖添加劑溶于1 ml去離子水的比例稱取適量的粉末進(jìn)行溶解,即為可用的緩沖添加劑的濃度,建議現(xiàn)用現(xiàn)配;
注:緩沖添加劑為白色粉末,較難準(zhǔn)確稱量,稱量范圍可稍微放寬,但是不應(yīng)超過±20%,且該粉末較易氧化,使用后請(qǐng)旋緊管蓋,如試劑出現(xiàn)棕黃色,則需報(bào)廢或更換。
按照以下的表格進(jìn)行染色反應(yīng)液的配制:
染色反應(yīng)液組分 |
500 μl |
1 ml |
2 ml |
5 ml |
1×反應(yīng)緩沖液 |
430 μl |
860 μl |
1.8 ml |
4.3 ml |
催化劑溶液 |
20 μl |
40 μl |
80 μl |
200 μl |
TAMRA紅色熒光溶液 |
1.2 μl |
2.5 μl |
5 μl |
12.5 μl |
緩沖添加劑 |
50 μl |
100 μl |
200 μl |
500 μl |
3、每孔加入100 μl 配置好的檢測(cè)混合液,以覆蓋細(xì)胞為宜,避光、室溫孵育30分鐘;
4、棄染色反應(yīng)液,加入100 μl 0.5% Triton X-100細(xì)胞滲透液清洗2-3次,每次10分鐘;
5、棄細(xì)胞滲透液,用PBS洗兩次,每次5分鐘。
DNA染色
1、將Hoechst 33342用RNase-free水溶液1:1000進(jìn)行稀釋得到終濃度為5 μg/ml的1×Hoechst染色液;
2、每孔加入100 μl 1×Hoechst染色液,室溫避光孵育20-30分鐘后,棄染色液;
3、每孔加入100 μl PBS洗細(xì)胞兩次,去掉洗液。
圖像獲取及分析
建議染色完成后立即進(jìn)行熒光顯微鏡拍照觀察;如果條件限制,請(qǐng)于4°C條件下避光濕潤保存3天之內(nèi)完成拍照。若為細(xì)胞爬片或涂片,可使用抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片后于4°C條件下保存及拍照檢測(cè)。
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